產品名稱：胚心肌組織來源細胞
英文簡稱：CCCS-HEH-2細胞

貨號：LZ-X969766
規格：T25
生長特性：貼壁

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凍存培養基：
凍存細胞時必須使用推薦的凍存培養基。凍存培養基中應含有 DMSO 或者甘油等冷凍保護劑。還可使用專門配制的*凍存培養基。
1）細胞凍存培養基是一種用于哺乳動物細胞的即用型*凍存培養基，其所含胎牛血清和牛血清比例經過優化，可改善細胞活力以及解凍后的細胞復蘇效果。 
2）凍存培養基是一種化學成分確定的、無蛋白、無菌凍存培養基，含10% DMSO，適用于多種干細胞和原代細胞 (黑色素細胞除外) 的凍存。
培養細胞凍存方案：
以下實驗方案介紹了培養細胞凍存的一般流程。詳細的實驗方案，必須參閱針對具體細胞的產品說明書。 
1.配制凍存培養基，于2°C至8°C下儲存，直至使用。請注意使用何種凍存培養基取決于所用細胞系。
2.凍存貼壁細胞時，利用傳代時所用方法輕柔地使細胞從組織培養容器上脫離下來。用該細胞所需*培養基重新懸浮細胞。
3.采用、細胞計數儀按照臺盼藍拒染法或者使用自動細胞計數儀測定總細胞數和活細胞百分比。根據所需活細胞密度，計算凍存培養基需要量。
4.以大約100-200×g的離心力將細胞懸液離心5至10分鐘。在無菌條件下小心倒掉上清液，不要攪動細胞沉淀。
注：離心速度和時間取決于細胞種類。
5.用預冷的凍存培養基重新懸浮細胞沉淀，將其調整至該細胞適合的活細胞密度。
6.將細胞懸液分裝到若干凍存管中。分裝時，應不時輕輕混合細胞，使其保持均勻的細胞懸液狀態。
7.使用可控制降溫速度的冷凍裝置冷凍細胞，使溫度每分鐘大約降低  1°C。或者，將裝有細胞的凍存管放入凍存盒中，然后將凍存盒置于-80°C條件下過夜。

實驗材料： 
1. 50ml 配制好的RPMI1640培養液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶 
2. 100ml滅菌燒杯2個；
3、50ml離心筒2個 
4、滅菌培養皿1個，細胞培養瓶1個 
5、1ml ，200μl移液器各1支；槍頭盒2個；無菌玻璃攪拌棒1個 
6、細胞計數板1塊； 
7、滅好菌的鑷子1把，剪刀1把； 
8、酒精燈1臺；

實驗報告：
一、分離與培養：
   1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；
   2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養基終止消化后4℃放置；
   3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；
   4、用200目不銹鋼篩網過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸，接種于25cm2培養瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養箱中培養；
   5、差速貼壁1h后，吸出培養基，按實驗需要接種于6孔板中繼續培養；
二、免疫熒光鑒定：
   1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；
   2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
   3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；
   4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；
   5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；
   6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微
鏡下觀察圖像并拍照。

注意事項：
     盡管經測試Annexin V-FITC反復凍融5次對于其檢測效果無顯著影響，但為取得良好的使用效果，3-6個月內推薦4℃保存，并適當注意避免反復凍融。
     如果有細菌或真菌污染，會嚴重影響檢測效果。
     染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導致凋亡或壞死細胞的數量增加。
     如果細胞收集過程中使用了胰酶，需注意設法去除殘留的胰酶。殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-FITC，導致染色失敗。
     熒光物質均易發生淬滅，在進行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。
     用于流式細胞儀檢測時，如果發現Annexin V-FITC單獨染色時出現了過多的PI假陽性細胞，并且通過調整相關設置和參數也無法改善，可以用PBS將Annexin V-FITC稀釋3-10倍后再進行檢測，這樣通常可以有效減少假陽性的壞死細胞。
     需自備PBS。
     本產品于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
     為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
8-氧黃連堿Inositol；肌超氧化物歧化酶（SOD）植物裂解樣品制備試劑盒

9’’’-丹酚酸B單甲酯Xylitol；木糖超氧化物歧化酶（SOD）組織裂解樣品制備試劑盒

9’-丹酚酸B單甲酯Liriope muscari baily saponins C；短葶山麥冬皂苷C超氧化物歧化酶（SOD）組織裂解樣品制備試劑盒

9-氨基喜樹堿Notopterol；羌活超氧陰離子清除劑TEMPOL溶液

9-甲氧基喜樹堿Artesunate；青蒿琥酯沉淀法去內素試劑盒

9-硝基喜樹堿Mogroside Ⅴ；羅漢果皂苷Ⅴ沉淀法去內素試劑盒

Alfa-葡萄素O-Phthalic acid；鄰苯二甲酸陳舊血紅溶解液

Alpha-軟脂酸香樹精酯Polygalasaponin F；瓜子金皂苷己持久型ECL化學發光顯影試劑盒

AlvocidibAstragalus Polysacharin；黃芪多糖持久型ECL免疫印跡化學發光溶液

BevirimatD-Isoascorbic acid；D-異抗壞血酸蟲卵活力和死亡體外裂卵（in vitro excystation）定量檢測試劑盒

BMS-188797DL-Menthol；DL-薄荷/薄荷腦蟲卵活力和死亡流式定量檢測試劑盒

CelgosivirThymol；麝香草酚蟲卵活力和死亡熒光定量檢測試劑盒

Cimiracemoside DEdaravone；依達拉奉初級離心柱DNA回收試劑盒

cis-紫莖女貞苷BGuaiacol；愈創木酚創傷弧菌（Vibrio vulnificus）鑒定16S rDNA PCR擴增檢測試劑盒

D-(-)-奎寧酸Chondroitin sulfate；硫酸軟骨素純化RNA樣品儲存液
CCCS-HEH-2細胞早期生長應答蛋白1抗體β-胡蘿卜素（標準品） DL-Selenomethionine

表皮膜蛋白1抗體β-欖香;β-嵐香(標準品) Melibiose

內皮受體蛋白酪氨激酶A抗體（腫瘤壞死因子α誘導蛋白4）β-萘黃(標準品) Sodium oxalate

酪氨蛋白激酶A4抗體β-石竹烯(標準品) Sodium tungstate, dehydrate

前列腺素E受體3抗體β-香樹素(標準品) Succinic anhydride

雌激素受體α抗體β-乙酰氧異戊酰阿卡寧 Tween-60

ENPP3抗體IgGγ-氨丁(GABA),標準品 Zymosan A from Saccharomyces cerevisiae

絲裂原活化蛋白激酶1/2抗體γ-倒捻子素 Calcium sulfate, anhydrous

胚胎干RAS蛋白抗體阿膠（標準品） DCC, Dicyclohexylcarbodiimide